MiR-124 mediato da Lentivirus per il trattamento di lesioni del midollo spinale

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I Lentivirus sono un genere di virus della famiglia dei Retroviridae. Il loro genoma è formato da due molecole di RNA monocatenario a polarità positiva e il loro nome è dovuto al lungo periodo di incubazione che segue l’infezione. A tale categoria appartengono i virus dell’HIV umano, HIV-1 ed HIV-2, agenti causa dell’AIDS.

La particella virale di HIV-1 ha una forma sferica del diametro di circa 100-120 nm ed è composta principalmente da proteine, lipidi e RNA. Il virione è caratterizzato da una membrana a doppio strato lipidico, chiamata envelope, che circonda un nucleocapside proteico a forma di cono. Ogni virione contiene un genoma composto da due molecole identiche di RNA monocatenario, fiancheggiato da due sequenze terminali ripetute (LTR), necessarie sia per la retrotrascrizione del genoma virale che per l’integrazione e trascrizione dei geni.

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Fig. 1: Virus dell’HIV

I vettori lentivirali sono stati principalmente sviluppati dal Virus dell’Immunodeficienza Umana di tipo 1 (HIV-1), dal Virus dell’Immunodeficienza della Scimmia (SIV) e dal Virus dell’Immunodeficienza Felina (FIV). Nella costruzione di un vettore lentivirale tutti gli elementi necessari per l’incapsidamento, retrotrascrizione ed integrazione del genoma virale sono mantenuti, mentre i geni gag, pol ed env sono rimossi.

Una volta modificati, i lentivirus possono essere utilizzati come vettori per l’espressione dei microRNA.

I microRNA (miRNA) sono una classe di piccole molecole endogene di RNA (circa 22 nucleotidi) non codificanti e a singolo filamento, che regolano una vasta gamma di processi fisiologici e di sviluppo come la crescita, il differenziamento e l’apoptosi delle cellule di mammifero.

Il primo miRNA, lin-4, scoperto in Caenorhabditis elegans da Victor Ambrose, fu inizialmente definito un stRNA (short temporal RNA), considerando la sua espressione cronologicamente ristretta e il suo ruolo nell’orchestrare il passaggio dallo stadio di larva a quello adulto nell’espressione genica di C. elegans.

L’analisi di sequenza predice l’esistenza di circa 2000 miRNA differenti. Tuttavia, solo un numero limitato di questi è stato definito funzionalmente attraverso overespressione, misespressione e knockdown in vitro. I miRNA modulano l’espressione genica utilizzando gran parte dell’apparato cellulare coinvolto nel fenomeno dell’interferenza dell’RNA e svolgono funzioni endogene precedentemente attribuite esclusivamente ai siRNA (piccoli RNA interferenti).

Attualmente sono noti molti approcci sperimentali che vertono sull’utilizzo dei microRNA in terapia genica antitumorale.

In un recente studio, invece, si è analizzata la correlazione tra la sovraespressione di miR-124 veicolato da lentivirus e la riparazione di lesioni del midollo spinale. Molti miRNA sono infatti neuro-specifici. Alcuni di essi sono coinvolti nello sviluppo del sistema nervoso e nella morfogenesi dei neuroni, in particolare nella crescita dei neuriti e nella formazione delle spine dendritiche e contribuiscono inoltre al controllo delle funzioni sinaptiche e della plasticità nell’adulto.

Studio in vitro

I ricercatori hanno isolato le cellule staminali mesenchimali di midollo osseo dai ratti e le hanno trasfettate con un vettore ricombinante lentivirale contenente il miR-124.

La sovraespressione di miR-124 è stata associata ad un incremento di marcatori neuronali come tubulina, MAP-2 e sinaptofisina già dopo 6 giorni di coltura in vitro, come rilevato dall’immunofluorescenza. Nel dettaglio:

  • Tubulina: marker specifico dei neuroni differenziati.
  • MAP-2: proteina specifica del dendrite, associata ai microtubuli, che svolge un ruolo importante nello sviluppo, formazione e rigenerazione del sistema nervoso.
  • Sinaptofisina: proteina sinaptica utilizzata come marcatore della formazione di sinapsi. Ciò indica che miR-124 non solo promuove la neurogenesi nelle cellule staminali mesenchimali di midollo osseo, ma stimola anche lo sviluppo delle sinapsi, essenziale per il recupero della funzione nervosa.

Inoltre, l’up regolazione del miR-124 stimola l’aumento dell’espressione di proteine coinvolte nella riparazione di lesioni del midollo spinale, ovvero le cosiddette proteine riparatrici, tra cui TRH, PGI2 e GM.

Studio in vivo

A seguito degli studi in vitro, si è proceduto alla sperimentazione in vivo. Le cellule mesenchimali trasfettate con miR-124 sono state iniettate nel midollo spinale di ratti con lesioni. L’analisi comportamentale ha mostrato un netto miglioramento della capacità motoria degli arti posteriori.

In conclusione, il miR-124 mediato da lentivirus accelera la capacità di differenziazione delle cellule staminali del midollo osseo in neurociti, promuovendo così la riparazione delle lesioni del midollo spinale nel modello di ratto. L’up-regolazione di miR-124 previene, inoltre, il processo di apoptosi indotta da deprivazione di ossigeno e glucosio ed esercita quindi un ruolo protettivo nelle cellule.

Questo studio preliminare pone le basi per ulteriori approfondimenti circa l’utilizzo di lentivirus come vettori specifici per la terapia genica di lesioni spinali.

 

Laura Oriunno

 

Fonti

Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 1993; 75: 843–854.

Song JL, Zheng W, Chen W, Qian Y, Ouyang YM, Fan CY. Lentivirus-mediated microRNA-124 gene-modified bone marrow mesenchymal stem cell transplantation promotes the repair of spinal cord injury in rats. Experimental & Molecular Medicine 2017; 49, e332; doi:10.1038/emm.2017.48.

Zou D, Chen Y, Han Y, Lv C, Tu G. Overexpression of microRNA-124 promotes the neuronal differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Neural Regen Res 2014; 9:1241-8.

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